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mRNA可視化プローブの開発
(関連する研究:β-actin mRNAの生細胞内1分子蛍光イメージング


RNAの塩基配列特異的にmRNAを認識検出する蛍光タンパク質プローブを分子設計し,生きた細胞内mRNAのイメージング法を開発しました. 標的とするRNAは,ミトコンドリアゲノムから合成されるNADH dehydrogenase subunit 6 (ND6)mRNAとしました.RNA結合タンパク質Pumilio(wtPUM)の 核酸認識アミノ酸にmutationを加え,NADH dehydrogenase subunit 6のmRNAを特異的に認識するmutant PUM(mPUM1, mPUM2)を作製しました. このmPUM1とmPUM2それぞれに,split したEGFPを連結しました.mRNAの発現に伴いmRNA-mPUM1-mPUM2三元錯体が形成されます. この時splitしたEGFPが近接して,EGFPタンパク質が折り畳まれ,その結果EGFPの蛍光が回復します.EGFPの蛍光シグナルからmRNAの局在を 蛍光顕微鏡により解析しました.

プローブをミトコンドリアにターゲットさせ,ミトコンドリアゲノムをDAPIで,ミトコンドリアをMitoTrackerで染色した後, RNAの局在を蛍光顕微鏡を用いて観察しました.RNAはミトコンドリアに一様に局在しますが,ミトコンドリアゲノム近傍に多く局在することを 明らかにしました.次にphotobleaching法を用いて,ミトコンドリア内におけるmRNAの動態観察を行いました.EGFPをbleaching後30分間の蛍光観察を行うと, EGFPはミトコンドリア内で殆ど移動しないことが解りました.これはミトコンドリアmRNAが自由には拡散移動できず, ミトコンドリア内で固定化された状態であることを示しています.現在,様々なmRNAをターゲットとして,その細胞内局在の時空間変化を解析しています.

Nature Methods4, 413–419 (2007).

RNA probe